Elisa检测原理 elisa的定义和原理

1、Elisa的原理年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显镜、电子显镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。ELISA原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。elisa kit使用方法（以人il4 elisa kit为例）：检测原理: 本实验采用双抗体夹心elisa法。抗人il抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人il，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在值之间呈正比，可通过绘制标准曲线出标本中il4的浓度。试剂盒组成： ×6）支；） ml/ml） 4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支） 5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；ml/ml） 6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支） 7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；ml/ml）瓶；ml） ml）．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；ml/6ml）．封板胶纸（6/3 张）．产品说明书（1 份）标本收集: 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。2. 血浆抗凝剂推荐使用edta 。避免使用溶血，高血脂标本。3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。℃电冰箱内，避免反复冻融，月内检测。5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数) 。注意事项: ℃ 。复溶后的标准品应分装后，将其放在℃贮存。5次使溶液混匀。℃）使用时洗涤液应为室温。℃贮存。避免反复冻融。5. 不同批的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。6. 充分轻混匀对反应结果尤为重要，最好使用量振荡器(使用最低频率)，如无量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试验结果。9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时，请按国家生物试验室安全防护条列执行。检测前准备工作: 分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。) 。未用完的放回4℃ 。、、、、、℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的标准品请废弃。:)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化抗体量不足，可向我们单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批） ?? 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足，可向我们单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批）洗涤方法: 秒。洗板5次。秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。操作步骤: 1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃ 。分钟。分钟准备生物素化抗体工作液。4．洗板5次。分钟。) ℃ 放置。7．洗板5次。分钟。9．开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。．洗板5次。．加入显色底物(tmb)ul/孔，避光℃孵箱，避光孵育分钟。．加入终止液ul/孔, 混匀后即刻测量od分钟内) 。在仪器保存读数结果并印一份纸质结果。．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。结果判断: 1. 每个标准品和标本的od值应减去空白孔的od值。2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，od值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的od值可在标准曲线上查出其浓度。3. 若标本od值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。灵敏度、特异性和重复性: ● 灵敏度：最小可测人il4达7pg/ml 。● 特异性：不与il－,,,,ifn,tnf及stnfrii等反应。● 重复性：板内，板间变异系数均<% 。il4简介： il期。il、 igga、iga和ige 。也增强单个核吞噬细胞表达mhcii类抗原，但对炎症性细胞因子（如il 也活化细胞毒性 t细胞，它被认为是典型的由th2细胞产生的细胞因子，对于t,b淋巴细胞的发育以及驱动体液免疫反应和抗体产生都是十分重要的。
2、ELISA原理和具体试验方法以及结果处理？ LISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HE多肽抗原包被孔板板条，这些多肽是中国型HE毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3 。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HE IgM抗体，这些抗体就会与HE 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgMHRP(辣根过氧化物酶)酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HE IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶底物反应，只有那些含有HE IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: IgM抗体elisa试剂盒的测试标准, ： 1. 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。ul于反应孔内。立即加入分钟。次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。分钟。次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。℃温育5分钟。避免光照。ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。nm波长处测定各孔的OD值。结果判断与分析： nm的酶标仪上读取各孔的OD值 2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的SB标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的SB含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。ng/ml 4、敏感度：包被抗原后加入待测抗体，反应后洗板，加入酶标二抗，反应后再洗板，加入底物显色。间接elisa方法主要用来检测抗体，例如我们对动物进行免疫后要检测抗血清的效价的话，就可以用间接elisa方法来测。
3、elisa原理是什么？免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性（）提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg标准品，，用合成的HE多肽抗原包被孔板板条，这些多肽是中国型HE毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3 。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HE IgM抗体，这些抗体就会与HE 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgMHRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HE IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶底物反应，只有那些含有HE IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: IgM抗体elisa试剂盒的测试标准,。1 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； 2 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 3 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
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